Laporan praktikum Sistematika mikroba

I.  PENDAHULUAN

1.1  Latar Belakang

Sistematika mikrobia merupakan ilmu yang mempelajari keanekaragaman mikrobia dan hubungan antar sesamanya, baik hubungan yang bersifat kemiripan (fenetik) maupun yang bersifat kekerabatan (filogenetis). Cakupan kajian dalam sistematika meliputi klasifikasi, tata nama, dan identifikasi. Klasifikasi merupakan suatu alat untuk mengelompokkan organisme ke dalam suatu kelompok (takson) berdasarkan hubungan kemiripan ataupun kekerabatan. Taksonomi adalah ilmu yang mempelajari tentang pengelompokkan dan penyusunan organisme dalam satu golongan yang disebut taxa. Hal ini dilakukan berdasarkan kriteria-kriteria tertentu sebagai pembeda yang digunakan dalam penggolongan organisme. Dalam taksonomi organisme terdiri dari tiga bagian, yaitu nomenklatur, klasifikasi, dan identifikasi. Nomenklatur merupakan kegiatan pemberian nama, sedangkan identifikasi berarti penetapan organisme menggunakan kriteria-kriteria yang ditetapkan dalam klasifikasi. Klasifikasi adalah tahap pengelompokkan suatu mikrobia berdasarkan sifat-sifat beda. ( Nicklin 1999 ).

Bakteri adalah domain yang terdiri dari makhluk hidup yang tidak memiliki membran inti (prokariota). Bakteri memiliki beragam variasi bentuk, seperti coccus, basil, dan spiral, serta dapat hidup soliter maupun berkoloni. Habitat bakteri sangat bervariasi dari air, tanah, udara, hingga dalam tubuh hewan. Bakteri umumnya tidak memiliki pigmen sehingga tidak berwarna dan hampir tidak kelihatan karena tidak kontras dengan medium dimana mereka hidup (Dwidjoseputro  2005).

Identifikasi dan klasifikasi bakteri yang belum dikenal dari suatu spesimen, hal utama yang harus dilakukan adalah dengan memperoleh biakan murni dari masing-masing organisme sebelum dilakukan berbagai langkah dalam pengidentifikasian untuk klasifikasi. Pengklasifikasian bakteri memiliki beberapa kesulitan, kriteria dalam klasifikasi bakteri berbeda dengan mengklasifikasikan tumbuhan tingkat tinggi ataupun hewan tingkat tinggi. Hal ini didasarkan terutama pada sifat-sifat morfologinya. Klasifikasi bakteri didasarkan pada sebagian sifat-sifat morfologi dan sifat-sifat fisiologinya termasuk imunologi. Pada dasarnya bakteri ketika di  bawah mikroskop menunjukkan bentuk morfologi yang sama, namun sifat-sifat fisiologi mereka berlainan antara yang satu dengan yang lain. Ada beberapa golongan bakteri yang sama bentuknya, namun yang berlainan fungsi dalam melangsungkan metabolisme. Ada pula suatu golongan yang dapat menyebabkan suatu penyakit, sedang golongan yang lain tidak, sehingga dari karakter tersebut  bakteri dapat diklasifikasikan berdasarkan sifat-sifat morfologi (Waluyo 2004).

Terdapat tiga cara klasifikasi yaitu klasifikasi artifisial, klasifikasi fenetik, dan klasifikasi filogenik. Salah satu penerapan klasifikasi fenetik adalah pada taksonomi numerik (numerical taxonomy) (Boone and Castenholz 2001). Taksonomi numerik merupakan suatu kajian kekerabatan taxa dengan mengaplikasikan nilai similaritas setiap karakter sehingga terdapat tingkatan kategori berdasarkan indeks similaritas. Sistem taksonomi ini digunakan sebanyak-banyaknya sifat kemudian dicari index similaritas (IS) dari mikrobia yang akan dikelompokkan (disebut OTUs). Ada dua macam Koefisien Asosiasi yaitu Simple Matching Coefisient (SSM) dan Jaccard Coeficient (SJ). Pada SSM semua sifat yang ada dilihat dan digunakan. Sedangkan pada SJ tidak memperhatikan sifat yang sama-sama tidak dimiliki (negatif). Kemudian dari matriks IS tersebut, akan diperoleh dendogram. Adapun dalam pengklasifikasian bakteri, kriteria yang dipakai antara lain adalah karakter morfologi yang meliputi ukuran, bentuk, sifat pengecatan dan lain-lain. Karakter kultur dan karakter koloni, meliputi bentuk koloni, elevasi, translucency dan warna. Karakteristik biokimia, meliputi fermentasi, hidrolisis, produksi indol, reduksi dan produksi enzym spesifik. Karakter fisiologi meliputi Range suhu, pH dan lain-lain (Sulia and Shantharam 1998).

Oleh sebab itu praktikum ini penting untuk dilaksanakan, karena dalam klasifikasi bakteri menggunakan klasifikasi numerik fenetik yang disatukan untuk mendapatkan hasil karakter bakteri yang tepat. Pada bentuk dan sifat - sifat klasifikasi yang dilakukan dalam praktikum ini akan memberikan suatu pembelajaran dan wawasan ilmu kepada mahasiswa dalam hal pengklasifikasian suatu bakteri.

1.2. Tujuan :

Adapun tujuan dari praktikum karakterisasi bakteri dengan metode taksonomi numerik fenetik adalah:  

1.      Memperkenalkan prosedur taksonomi numerik fenetik dalam klasifikasi bakteri.

2.      Mengidentifikasi bakteri melalui uji morfologi.

3.      Menuntukan bentuk morfologi koloni bakteri.

4.      Menuntukan bentuk morfologi sel bakteri.

5.      Mengidentifikasi bakteri melalui uji biokimia

6.      Menguji kemampuan bakteri dalam pencairan gelatin.

7.      Menguji kemampuan bakteri dalam mereduksi methylen blue.

8.      Mendeteksi adanya enzim katalase pada bakteri, mendeteksi kemampuan bakteri dalam hal menghidrolisis kasein dan pati dan mendeteksi kemampuan bakteri menfermentasi karbohidrat.

1.3  Manfaat :

Manfaat dari praktikum karakterisasi bakteri dengan metode taksonomi numerik fenetik ini kita  dapat memahami  prosedur taksonomi numerik fenetik dalam mengklasifikasi bakteri, mampu mengidentifikasi bakteri melalui uji morfologi dan dapat melakukan pengidentifikasian bakteri isolat C melalui uji biokimia.

II.     TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian Bakteri

Bakteri merupakan salah satu jenis organisme yang tidak mempunyai inti sel selayaknya organisme lainnya. Bakteri memiliki ciri-ciri yang membedakannnya dengan mahluk hidup lain yaitu organisme multiselluler, prokariot (tidak memiliki membran inti sel), umumnya tidak memiliki klorofil, memiliki ukuran tubuh yang bervariasi antara 0,12 s/d ratusan mikron umumnya memiliki ukuran rata-rata 1 s/d 5 mikron, memiliki bentuk tubuh yang beraneka ragam, hidup bebas atau parasit dapat hidup di lingkungan ekstrim seperti pada mata air panas,kawah atau gambut dinding selnya tidak mengandung peptidoglikan, yang hidupnya kosmopolit diberbagai lingkungan dinding selnya mengandung peptidoglikan (Yusra 2014).

2.2 Penegertian Klasifikasi  Taksonomi Numerik Fenetik

Klasifikasi mikrobia, terdapat tiga macam cara yaitu klasifikasi artifisial, klasifikasi fenetik, dan klasifikasi filogenetik. Contoh penerapan klasifikasi fenetik adalah pada taksonomi numerik (numerical taxonomy) (Boone dan Castenholz 2001). Taksonomi dapat dilakukan secara numerik ataupun secara fenetik, dimana taksonomi secara numerik (numerical taxonomy), adalah taksonomi yang dikelompokkan berdasarkan pada informasi sifat suatu organisme yang dikonversikan ke dalam bentuk yang sesuai untuk analisis numerik dan dibandingkan menggunakan komputer, ada atau tidaknya sekurang-kurangnya 50. Taksonomi numeric (Taksonomi Adansonian) memiliki tujuan utama yaitu untuk menghasilkan suatu klasifikasi yang bersifat teliti, reprodusibel serta padat informasi. (Boone dan  Castenholz  2001).  Taksonomi numerik diawali dengan analisis karakter yang diuji dengan berbagai uji, antara lain: uji morfologi, fisiologi dan sifat biokimiawi yang menghasilkan data fenotip yang beragam, data fenotip yang didapat, diolah lebih lanjut sehingga menghasilkan koefisien similaritas, yaitu sebuah fungsi yang mengukur tingkat kemiripan yang dimiliki oleh dua atau lebih stain mikroba yang dibandingkan, yang diperoleh dari karakter yang dibandingkan antar dua atau lebih strain mikroba. Koefisien ini terdiri atas dua jenis yaitu, Simple Matching Coeficient (Ssm) merupakan koefisien similaritas yang umum digunakan pada ilmu bakteriologi untuk mengukur proporsi karakter yang sesuai, baik hubungannya bersifat ada (positif) maupun tidak ada (negatif). Sedangkan Jaccard Coeficient (SJ) dihitung, tanpa memperhitungkan karakter yang tidak dimiliki oleh kedua organisme tersebut (Pelczar 2005).

Berdasarkan konsep takso spesies, jika indeks similaritas yang dimiliki antar mikrobia ≥ 70% maka mikrobia tersebut dapat dikatakan merupakan spesies yang sama (Priest dan Austin 1993). Fenetik merupakan suatu studi klasifikasi berbagai macam organisme berdasarkan kesamaan atau kemiripan morfologi dan sifat lainnya yang bisa diobservasi tidak tergantung pada asal evolusi organisme bersangkutan dan pada analisis filogenetik. Taksonomi fenetik merupakan suatu sistem klasifikasi mikroba tanpa mempertimbangkan sifat evolusioner. Pengukuran kekerabatan berdasarkan sifat fenotip dan genotip, misalnya penentuan sifat biokimia, morfologi, fisiologi, kimiawi dan pembedaan DNA. Salah satu cara yang paling mudah dalam membandingkan Operational Taxonomical Unit (OTU) adalah dengan mencari jumlah karakter yang identik diantara masing-masing individu yang disebut sebagai koefisien asosiasi (Stanier et al 1982).

2.3 Kelebihan dan Kekurangan Taksonomi Numerik Fenetik

Kelebihan Taksonomi numerik didasarkan atas analisis kuantitatif dan lebih bersifat objektif, reproducible dan padat informasi. Penggunaan taksonomi numerik sering dilakukan dalam klasifikasi dan identifikasi mikrobia khususnya bakteri (Sembiring 2002). Kelemahan metode taksonomi numerik fenotipik terkait tingkat repsodusibilitasnya, metode fenotik memberikan hasil yang berbeda-berbeda apabila diulang, sehingga dianggap kurang handal. Selain itu, metode ini juga mengkarakterisasi organisme berdasarkan produk ekspresi gen yang sangat sensitif terhadap berbagai macam kondisi lingkungan seperti suhu pertumbuhan, fase pertumbuhan dan mutasi spontan. Kelemahan metode fenotik ini menjadi dasar pengembangan metode genotipik berbasis DNA (uji Molekular), sehingga metode genotipik berbasis DNA menjadi lebih popular dan diterim secara luas karena bersifat reprodusibel, praktis, menunjukan perbedaan antar spesies yang lebih kontras serta dapat membantu menghindari duplikasi strain (Ristiati  2000).

2.4 Identifikasi Bakteri Dari Beberapa Penelitian

Penelitian Isolasi, identifikasi dan karakterisasi bakteri asam laktat dari dadih susu oleh Rofiq Sunaryanto dan Bambang Marwoto didapatkan Isolat yang diduga sebagai Lactobacillus dengan memenuhi kriteria mempunyai sifat katalase negatif, pewarnaan Gram-positif, nonmotil, dan bentuk sel batang. Identifikasi Isolat Lactobacillus (Sunaryanto dan Marwoto 2013).

Penelitian Identifikasi bakteri pada depot air minum isi ulang di kota Manado yang diteliti Perisai P. Rumondor,  John Porotu’o  dan Olivia Waworuntu hasil dari pemeriksaan bakteri dari 20 sampel air yang diperiksa, ditemukan semua sampel menunjukkan pertumbuhan bakteri. Bakteri Gram positif yang ditemukan pada kultur yaitu 4 sampel, bakteri Gram negatif yang ditemukan yaitu 5 sampel dan campuran bakteri Gram positif dan negatif yang ditemukan yaitu 11 sampel. Jenis bakteri yang paling sering ditemu-kan adalah Bacillus subtilis (Rumondor et al 2014).

Penelitian Isolasi dan identifikasi bakteri pektinolitik dari tanah mangrove di Margomulyo Balikpapan, Kalimatan Timur yang dilakukan Putri M. Al Asna dan  Febriani S. Nugraheni didaptakan Ada lima spesies bakteri pektinolitik yang berasal dari tanah mangrove di daerah Margomulyo Balikpapan Kalimantan Timur, yaitu; Vibrio parahemoliticus, Providensia stuartii, Pseudomonas pseudomallei, Listeria monocytogenes, , dan Bacillus cereus ( Asna et al 2017 ).

III.  METODE

3.2    Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah  bunsen, cawan petri, cover glass, erlenmeyer, gelas beaker, gelas objek, hot plate, jarum ose, keranjang, kertas merang, mikroskop, pipet tetes ,rak tabung reaksi, tabung reaksi, dan tutup testube.

Bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah medium NA miring, medium NA tegak, Medium NA plate, medium pati, medium gelatin, medium agar susu skim, bakteri isolat C, alkohol, Nutrient Broth (NB), aquades, metilen blue, kristal violet, iodin, safranin, JKJ, larutan H₂ O₂ , endospora, malachite green, kertas merang, glukosa cair, sukrosa cair, maltosa cair, dan laktosa cair.

3.3    Cara kerja

3.3.1   Morfologi Koloni

A.    NA Miring

1.    Isolat bakteri C dipersiapkan.

2.    Jarum ose bulat disterilkan.

3.    Bakteri isolat C diambil secara aseptis dengan menggunakan jarum ose bulat.

4.    Isolat pada jarum ose distreak lurus pada medium NA miring.

5.    NA miring yang berisi isolat bakteri C diinkubasi selama 24 jam dan dilakukan pengamatan.

B.     NA Tegak

1.    Isolat C dipersiapkan

2.    Jarum ose lurus disterilkan.

3.    Bakteri isolat C diambil secara aseptis dengan menggunakan jarum ose lurus.

4.    Isolat pada jarum ose ditusuk sedalam ¾ menggunakan jarum ose lurus.

5.    NA tegak yang berisi isolat bakteri C diinkubasi selama 24 jam dan dilakukan pengamatan.

C.     NA Plate

1.    Medium NA dan isolat C diambil terlebih dahulu.

2.    Medium NA dituangkan kecawan petri.

3.    Jarum ose bulat disterilkan.

4.    Bakteri isolat C diambil secara aseptis dengan menggunakan jarum ose bulat.

5.    Isolat pada jarum ose ditotol-totolkan sebanyak 4 totol dengan menggunakan jarum ose bulat.

6.    NA plate yang berisi isolat C diinkubasi selama 24 jam dan dilakukan pengamatan.

D.    Nutrient Broth (NB)

1.    Medium NB dan isolat C diambil terlebih dahulu.

2.    Jarum ose bulat disterilkan.

3.    Bakteri isolat C diambil secara aseptis menggunakan jarum ose bulat.

4.    Isolat pada jarum ose diinokulasi ke NB dengan menggunakan jarum ose bulat.

5.    NB yang berisi isolat C diinkubasi selama 24 jam dan dilakukan pengamatan.

3.3.2   Morfologi Sel

A.  Pewarnaan Sederhana

1.      Gelas objek disterilkan terlebih dahulu.

2.      Gelas objek diteteskan dengan 1 tetes aquades

3.      Bakteri isolat C diambil secara aseptis dengan menggunakan jarum ose bulat.

4.      Isolat C pada jarum ose diinokulasi diatas gelas objek.

5.      Gelas objek yang berisi isolat C difiksasi.

6.      Isolat C pada gelas objek diteteskan dengan metilen blue dan didiamkan selama 5 menit.

7.      Gelas objek dicuci dengan menggunakan aquades.

8.      Gelas objek dikering anginkan.

9.      Gelas objek ditutup dengan cover glass dan amati dengan menggunakan mikroskop dengan pebesaran 4 x 10.

B.  Pewarnaan Gram

1.      Gelas objek disterilkan terlebih dahulu.

2.      Gelas objek diteteskan dengan 1 tetes aquades.

3.      Bakteri isolat C diambil secara aseptis dengan menggunakan jarum ose bulat.

4.      Isolat pada jarum ose diinokulasi diatas gelas objek.

5.      Gelas objek yang berisi isolat C difiksasi.

6.      Isolat C pada gelas objek diteteskan dengan kristal violet dan didiamkan selama 1 menit.

7.      Gelas objek yang berisi isolat C dicuci dengan menggunakan aquades.

8.      Gelas objek yang berisi isolat C dikering anginkan.

9.      Gelas objek yang berisi isolat C diteteskan iodin dan didiamkan selama 1 menit.

10.  Gelas objek yang berisi isolat C  dicuci dengan menggunakan aquades.

11.  Gelas objek yang berisi isolat C  dikering anginkan.

12.  Gelas objek yang berisi isolat C  ditambahkan dengan menggunakan alkohol

13.  Gelas objek yang berisi isolat C dicuci dan dikering anginkan.

14.  Gelas objek yang berisi isolat C diteteskan safranin dan didiamkan selama 45 detik.

15.  Gelas objek yang berisi isolat C dicuci dan dikering anginkan

16.  Gelas objek yang berisi isolat C  ditutup dengan menggunakan cover glass dan amati dengan menggunakan mikroskop dengan perbesaran 4x10.

C.  Pewarnaan Endospora

1.      Gelas objek ditetesi Aquades sebanyak 1 tetes.

2.      Endospora diinokulasi kegelas objek dengan menggunakan jarum ose bulat.

3.      Fiksasi di dekat bunsen.

4.      Gelas objek berisi endospora ditutup dengan kertas merang dan diteteskan dengan malachite green.

5.      Gelas objek berisi endospora diletakkan diatas air yang mendidih dan didiamkan selama 5 menit sampai mengering.

6.      Setelah dingin , gelas objek berisi endospora diteteskan dengan aquades

7.      Gelas objek berisi endospora diteteskan safranin dan didiamkan sekitar 45 detik.

8.      Gelas objek berisi endospora dicuci dan dikering anginkan.

9.      Gelas objek berisi endospora ditutup dengan cover glass dan amati dengan menggunakan mikroskop perbesaran 4x10.

3.3.3   Uji Biokimia

A.   Hidrolisis Pati

1.      Medium dan isolat C disediakan.

2.      Medium pati dituangkan kedalam cawan petri dan didiamkan hingga mengeras.

3.      Isolat C diambil dan ditotolkan 1 ditengah medium pati.

4.      Medium pati yang berisi isolat C diinkubasi selama 48 jam.

5.      JKJ diteteskan pada media yang telah diinokulasi isolat C.

6.       Zona bening diamati.

B.  Reduksi Metilen Blue

1.      Medium NB diambil terlebih dahulu.

2.      Jarum ose bulat disterilkan.

3.      Bakteri isolat C diambil secara aseptis dengan menggunakan jarum ose bulat.

4.      Isolat C pada jarum ose dicelupkan dengan menggunakan NB.

5.      NB diinkubasi selama 24 jam.

6.      NB diteteskan dengan metilen blue.

7.      Hilangnya warna biru pada metilen blue diamati.

C.  Uji Katalase

1.      Gelas objek disterilkan.

2.      Bakteri isolat C diinokulasi sebanyak 1 ose dari gelas objek.

3.      Gelas objek diteteskan H₂O₂.

4.      Isolat diamati apakah ada atau tidak gelembung gasnya.

D.  Uji Gelatin

1.      Jarum ose lurus disterilkan.

2.      Bakteri isolat C diambil secara aseptis dengan menggunakan jarum ose lurus.

3.      Isolat pada jarum ose ditusuk ¾ dalam tabung reaksi

4.      Medium gelatin diinkubasi selama 48 jam.

5.      Medium gelatin dimasukkan ke dalam kulkas selama 1 jam.

6.      Pada medium diamati terbentuk padatan atau tidak. Hasil positif menunjukkan medium gelatin tidak dapat memadat.

E.  Uji Fermentasi Karbohidrat

1). Glukosa

1.      Medium uji phenol red glukosa diambil terlebih dahulu.

2.      Jarum ose disterilkan.

3.      Bakteri isolat C dicelupkan kedalam medium glukosa dengan menggunakan jarum ose bulat.

4.      Medium glukosa diinkubasi selama 24-48 jam.

5.      Perubahan warna diamati dan adanya gas yang terbentuk.

2). Maltosa

1.    Medium uji phenol red maltosa diambil terlebih dahulu.

2.    Jarum ose disterilkan.

3.    Bakteri isolat C dicelupkan kedalam medium maltosa dengan menggunakan jarum ose bulat.

4.    Medium maltosa diinkubasi selama 24-48 jam.

5.    Perubahan warna diamati dan adanya gas yang terbentuk.

3). Laktosa

1.    Medium uji phenol red laktosa diambil terlebih dahulu.

2.    Jarum ose disterilkan.

3.    Bakteri isolat C dicelupkan kedalam medium laktosa dengan menggunakan jarum ose bulat.

4.    Medium laktosa diinkubasi selama 24-48 jam.

5.    Perubahan warna diamati dan adanya gas yang terbentuk.

4). Sukrosa

1.    Medium uji phenol red sukrosa diambil terlebih dahulu.

2.    Jarum ose disterilkan.

3.    Bakteri isolat C dicelupkan kedalam medium sukrosa dengan menggunakan jarum ose bulat.

4.    Medium sukrosa diinkubasi selama 24-48 jam.

5.    Perubahan warna diamati dan adanya gas yang terbentuk.

F.   Uji Hidrolisis Kasein

1.      Medium susu skim dan isolat bakteri C disediakan.

2.      Jarum ose bulat disterilkan.

3.      Bakteri isolat C diinokulasikan dengan cara di streak menggunakan jarum ose bulat  pada medium susu skim secara aseptis,

4.      Medium susu skim yang telah berisi isolat C diinkubasi selama 4 hari lalu diamati ada tidaknya zona bening.

IV.  HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

A. Tabel 1. Hasil Pengamatan Uji Bakteri Kelas Sistematika Mikroba A

No	Unit Karakter (n)	Operational Taxonomi Unit OTU (t)
		A	B	C	D	E	F	G	H	I
	Morfologi Koloni
	Pertumbuhan Bakteri di NA Tegak
1	Papilliate	-	+	-	+	+	-	+	-	+
2	Filiform	+	-	-	-	-	-	-	-	-
3	Echinulate	-	-	+	-	-	-	-	-	-
4	Plumose	-	-	-	-	-	+	-	-	-
5	Beaded	-	-	-	-	-	-	-	+	-
	Pertumbuhan Bakteri  di NA Miring
6	Filiform	+	-	-	-	-	-	-	-	-
7	Effuse	-	+	-	-	-	-	-	-	+
8	Spreading	-	-	+	+	+	+	+	-	-
9	Beaded	-	-	-	-	-	+	-	-	-
10	Echinulate	-	-	-	-	-	-	-	+	-
	Pertumbuhan Bakteri di NA Plate
	Ukuran koloni
11	Large	-	-	-	-	-	-	-	+	-
12	Moderate	+	+	+	+	-	+	+	-	+
13	Small	-	-	-	-	+	-	-	-	-
	Bentuk koloni
14	Irregular	+	-	-	+	+	+	+	+	-
15	Sirkular	-	+	+	-	-	-	-	-	+
	Tepian
16	Undulate	+	+	+	+	+	+	-	+	+
17	Entire	-	-	-	-	-	-	+	-	-
	Elavasi
18	Raised	+	+	+	-	-	-	-	+	-
19	Umbonate	-	-	-	+	-	-	+	-	-
20	Convex	-	-	-	-	+	-	-	-	-
21	Flat	-	-	-	-	-	+	-	-	+
	Pertumbuhan Bakteri di NB
22	Sedimen	+	-	-	+	-	-	+	-	-
23	Pelicle	-	+	+	-	+	+	-	+	-
24	Uniform turbidity	-	-	-	-	-	-	-	-	+
	Morfologi  Sel
	Pewarnaan Sederhana
25	Basil	+	+	-	+	-	-	-	-	-
26	Coccus	-	-	+	-	-	+	+	+	+
27	Staphylococcus	-	-	-	-	+	-	-	-	-
	Pewarnaan gram
28	Gram-	+	+	+	-	+	-	-	+	-
29	Gram +	-	-	-	+	-	+	+	-	+
	Uji Sifat Biokimia
30	Hidrolisis Pati	+	-	+	-	+	+	-	+	+
31	Uji katalase	-	-	-	-	-	-	+	-	-
	Perubahan warna
	Uji glukosa
32	Glukosa ++	-	-	-	+	-	-	-	-	-
33	Glukosa +++	-	+	+	-	-	+	+	+	+
34	Glukosa ++++	+	-	-	-	+	-	-	-	-
	Uji maltose
35	Maltosa +	-	-	-	+	-	-	+	+	-
36	Maltosa ++	-	+	+	-	-	+	-	-	+
37	Maltosa +++	+	-	-	-	-	-	-	-	-
	Uji laktosa
38	Laktosa +	-	+	+	-	+	+	-	-	+
39	Laktosa ++	-	-	-	-	-	-	+	+	-
40	Laktosa +++	+	-	-	-	-	-	-	-	-
	Uji sukrosa
41	Sukrosa +	+	-	-	-	-	-	-	-	-
42	Sukrosa ++	-	+	-	-	-	-	-	-	-
43	Sukrosa +++	-	-	+	+	-	-	-	-	-
44	Sukrosa ++++	-	-	-	-	-	+	+	+	+
	Gelembung glukosa
45	Tidak ada gelembung	-	-	-	-	-	-	-	-	+
46	Gelembung sedikit	-	+	+	-	-	-	-	-	-
47	Gelembung sedang	-	-	-	+	-	-	-	+	-
48	Gelembung banyak	+	-	-	-	+	+	+	-	-
	Gelembung maltose
49	Tidak ada gelembung	-	+	+	-	-	-	-	-	+
50	Gelembung sedikit	-	-	-	-	-	-	+	-	-
51	Gelembung sedang	+	-	-	+	+	-	-	-	-
52	Gelembung banyak	-	-	-	-	-	+	-	+	-
	Gelembung Laktosa
53	Tidak ada gelembung	-	+	+	+	-	-	-	-	+
54	Gelembung sedikit	-	-	-	-	+	-	-	-	-
55	Gelembung sedang	+	-	-	-	-	+	+	-	-
56	Gelembung banyak	-	-	-	-	-	-	-	+	-

B. Perhitungan Indeks Similaritas

1). Perhitungan  Jaccard Coefficient (SJ)

 

 

 

2). Perhitungan  Simple Maching Coefficient (SSm)

 

 

          

 

\

 

 

4.2 PEMBAHASAN

            Praktikum sistematika mikroba ini menggunakan prosedur analisis taksonomi numerik – fenetik. Taksonomi numerik- fenetik merupakan satu cara untuk mendapatkan suatu hasil klasifikasi yang objektif berdasarkan sebanyak-banyaknya karakter dan proses penataan organisme ke dalam suatu kelompok (takson) berdasarkan hubungan kemiripan (nilai similaritas) secara kuantitatif (Pelczar 2005). Strain bakteri yang digunakan yaitu strain A, B, C, D, E , F ,G , H dan I. Masing masing strain tersebut di karakterisasi dengan pengamatan dan pengujian. Pengamatan meliputi sifat morfologi, baik koloni maupun sel dan dilanjutkan dengan pengujian sifat biokimia. Karakter – karakter yang digunakan dalam percobaan ini adalah sebanyak 56 karakter.

            Kelebihan Taksonomi numerik didasarkan atas analisis kuantitatif dan lebih bersifat objektif. Penggunaan taksonomi numerik sering dilakukan dalam klasifikasi dan identifikasi mikrobia khususnya bakteri (Sembiring 2002). Kelemahan metode taksonomi numerik fenotipik terkait tingkat repsodusibilitasnya, metode fenotik memberikan hasil yang berbeda-berbeda apabila diulang, sehingga dianggap kurang handal (Ristiati  2000).

Berdasarkan unit karakter yang telah diamati, didapatkan konstruksi dendogram dari perhitungan Ssm merupakan koefisien similaritas yang umum digunakan pada ilmu bakteriologi untuk mengukur proporsi karakter yang sesuai, baik hubungannya bersifat ada (positif) maupun tidak ada (negatif). Sedangkan Jaccard Coeficient (SJ) dihitung, tanpa memperhitungkan karakter yang tidak dimiliki oleh kedua organisme tersebut (Pelczar 2005). Menurut Lay (1994) tingkat kepercayaan lebih baik menggunakan Ssm karena tidak mengabaikan karakter yang tidak ada pada masing-masing strain dan persentase kemiripan ≥70%, dimana (-) pada kedua strain tetap dihitung. Sedangkan pada Sj mengabaikan karakter yang tidak ada pada kedua strain tersebut, dimana nilai (-) tidak dihitung dan persentase kemiripan ≤ 70%.

Berdasarkan hasil perhitungan nilai similaritas dengan menggunakan Ssm maka strain bakteri yang di amati dapat di golongkan menjadi dua species karena memiliki beberapa sifat yang berbeda dan nilai similaritasnya ≥ 70%.  Jumlah spesies bakteri SJ adalah sebanyak 8 spesies sedangkan dengan metode SJ sebanyak 1 spesies.

Berdasarkan hasil praktikum sistematika mikro ini dilakukan pengamatan yaitu morfologi koloni, morfologi sel dan uji biokimia.

4.2.1 Morfologi Koloni

Pada praktikum morfologi koloni ada 3 uji yang dilakukan untuk mengidentifikasi suatu bakteri, yang dilihat adalah pertumbuhan bakteri yaitu NA Tegak, NA Miring, NB Plate dan NB Cair. Morfologi yang diamati adalah dari perumbuhan, bentuk pertumbuhan, ukuran koloni, bentuk koloni, tepian koloni dan elevasi koloni tersebut.

1. NA Tegak

            Pada NA tegak yang telah diinkubasi dengan beberapa isolat selama 24 jam. Berdasarkan pengamatan yang dilakukan pada bakteri yang ditumbuhkan dari beberapa isolat bakteri, strain bakteri didapatkan hasil yaitu pada medium NA tegak pada isolat B, isolat D, isolat E, isolat G, isolat I bentuk pertumbuhan Papilliate. NA tegak pada isolat A bentuk pertumbuhan Filiform. Pada isolat C bentuk pertumbuhan Echinulate yang mana pertumbuhan merata. NA tegak pada isolat F bentuk pertumbuhan Plumose. NA tegak pada isolat H bentuk pertumbuhan Beaded.

2. NA Miring

            Hasil pertumbuhan strain bakteri pada NA miring didapatkan beragam bentuk, yang telah diinkubasikan selama 24 jam. Pertumbuhan strain bakteri pada NA miring berbentuk Spreading didapatkan pada isolat C, isolat D, isolat E, isolat F dan isolat G. Pertumbuhan strain bakteri pada NA miring berbentuk Filiform  didapatkan pada isolat A. Pada isolat B dan isolat I bentuk pertumbuhan NA miring Effuse. Pada isolat F bentuk pertumbuhan NA miring Beaded. Pada isolat H bentuk pertumbuhan NA miring Echinulate.

3. NA plate

            Pertumbuhan Bakteri di NA Plate yang telah diinkubasikan selama 24 jam dilihat dari ukuran koloni pada ukuran koloni Large terdapat pada isolat H, ukuran koloni Moderate terdapat pada isolat A, isolat B, isolat C, isolat D, isolat F, isolat G dan isolat H. Isolat E berukuran koloni small. Terdapat 2 bentuk koloni yaitu bentuk Irregular pada isolat A, isolat D, isolat E, isolat F, isolatG dan isolat H. Bentuk sirkular terdapat pada isolat B, isloat C dan isolat I. Pada isolat A, isolat B, isolat C, isolat D, isolat E, isolat F, isolat H dan isolat I bentuk tepian yaitu Undulate. Bentuk tepian Entire terdapat pada isolat G. Elevasi pada isolat A, isolat B, isolat C dan isolat H berbentuk Raised. Isolat D dan isolat G bentuk elevasi yaitu Umbonate. Convex adalah bentuk elevasi pada isolat E dan elevasi pada isolat F dan isolat I berbentuk Flat.

4. NB Cair

Pertumbuhan Bakteri di NB yang tidak di berikan metilen blue menunjukan pada isolat A, isolat D dan isolat G terbentuk sedimen. Pelicle terbentuk pada isolat B, isolat C, isolat E, isolat F dan isolat H. Pada isolat I adanya terbentuk uniform turbidity.

4.2.2 Morfologi Sel

1. Pewarnaan Sederhana

                 Hasil pewarnaan sederhana pada sel dari setiap isolat menunjukan adanya 3 bentuk yaitu basil, coccus dan staphylococcus. Isolat A, isolat B dan isolat D menunjukan bentuk basil dari hasil pewarnaan. Bentuk coccus terdapat pada isolat C, isolat F, isolat G, isolat H dan isolat I. Bentuk staphylococcus didapatkan pada isolat E. Pewarnaan sederhana pada isolat praktikan yaitu isolat C menunjukan bentuk coccus dengan perbesaran 4x10. Pewarnaan sederhana ini hanya menggunakan satu larutan pewarnaan yaitu metilen blue yang bersifat alkolin dan termasuk kedalam pewarnaan Asam merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat dan mengetahui bentuk sel bakteri yang diamati dimikroskop (Waluyo 2004).

2. Pewarnaan Gram

            Pewarnaan gram atau metode gram adalah  salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas di gunakan untuk mengidentifikasi bakteri (Pelczar 2005). Hasil pewarnaan gram menunjukan gram positif terdapat pada isolat A, isolat B, isolat C, isolat F dan isolat H. Pada gram negatif terdapat pada isolat D, isolat F, isolat G dan isolat I. Pada isolat praktikan yaitu isolat C didapatkan hasil yaitu bakteri berwarna ungu yang menandakan strain bakteri C  termasuk kedalam bakteri gram positif dengan bentuk coccus pada perbesaran 40x10. Pada pewarnaan gram terdapat dua kemungkinan yaitu bakteri gram postif dan negtaif Perbedaan warna ini di sebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. Kristal violet digunakan sebagai pewarna utama yang akan mewarnai seluruh permukaan sel bakteri gram positif dan negatif. Larutan mordant (lugol iodin) menyebabkan adanya ikatan cv dengan iodin yang meningkatkan afinitas. Penetesan ethanol absolut menyebabkan terbentuknya pori-pori pada gram negatif yang memiliki banyak lapisan lemak. Safranin sebagai warna penutup dimana safrani akan mewarnai set gram negatif menjadi bewarna merah sedangkan gram positif tidak terpengaruh countersain hanya sebagai pengontras saja. (Pelczar 2005).

3.  Pewarnaan Endospora

            Pewarnaan spora adalah salah satu pewarnaan dengan menggunakan malachite green dan safranin yang dalam hasil pewarnaannya akan muncul warna hijau pada spora dan mewarnai sel vegetatif bakteri. Malachite green digunakan untuk mewarnai sel vegetatif bakteri. Endospora sukar menyerap zat warna, sekali diberi zat warna warna tersebut sulit dilunturlkan. Pemanasan digunakan untuk mempermudah penetrasi malachite green ke dinding spora. Safranin akan mewarnai sel vegetatif menjadi warna merah tetapi tidak mempengaruhi warna hijau endospora. Tidak semua bakteri menghasilkan spora, hanya bakteri tertentu saja Bacillus, Clostridium dan Sporosarcina (Pelczar 2005). Pada praktikum pewarnaan endospora tidak tampak endospora pada strain bakteri A, strain bakteri B, strain bakteri C, strain bakteri D, strain bakteri E, strain bakteri F, strain bakteri

G, strain bakteri H  dan strain bakteri I yang diamati.

4.2.3 Uji Biokimia

1. Hidrolisis Pati

            Uji hidrolisis pati adalah untuk melihat kemampuan bakteri dalam menghidrolisis pati dengan cara menghasilkan enzim amilase. Hidrolisis pati menggunakan larutan JKJ yang berfungsi sebagai indikator adanya larutan amilum. Hidrolisis pati akan  muncul adanya zona bening di sekitar koloni bakteri menunjukkan positif hidrolisis pati (Dwidjoseputro 2005). Berdasarkan hasil percobaan menunjukkan ditemukannya zona bening pada isloat A, isolat C, isolat E, isolat F, isolat H dan isolat I menunjukan bahwa bakteri positif terhadap hidrolisis pati. Terdapat bakteri negatif terhadap hidrolisis pati yaitu isolat B, isolat D, isolat G yang menunjukan bahwa tidak terdapat zona bening. Hal tersebut dikarenakan pada saat pengambilan isolat bakteri kurang aseptis dan kurang ketelitian dalam mengamati.

2. Uji Reduksi Metilen Blue

            Percobaan uji methylen blue hasil postif bagi reduksi methylen blue ditandai dengan hilangnya warna biru. Semakin banyak jumlah bakteri yang terdapat dalam medium cair yang dicampurkan dengan metilen blue maka akan makin semakin cepat hilangnya warna biru dari metilen blue (Dwidjoseputro 2005). Pada uji metilen blue hasil dari setiap isolat menunjukan negatif, tidak terjadinya perubahan warna dari biru menjadi bening pada medium NB yang berisi strain bakteri. Hal tersebut terjadi, dikarenakan pada pengambilan isolat bakteri kurang ketelitian dan kurang aseptis.

3. Uji Katalase

            Uji katalase merupakan suatu pengujian terhadap bakteri tertentu untuk mengetahui termasuk bakteri aerob, anaerob fakultatif atau anaerob obligat. Bakteri menghasilkan hidrogen peroksida yang sebenarnya beracun bagi bakteri. Bakteri tetap hidup dengan adanya antimetabolit, baketri mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen dengan reaksi sebagai berikut:

2H₂O₂                  2H₂O + O²

Larutan H₂O₂ berfungsi untuk mengetahui ada tidaknya gelembung udara pada bakteri (Waluyo 2004). Berdasarkan hasil percobaan uji katalase negatif  terdapat pada isolat A, isolat B, isolat C, isolat D, isolat E, isolat F, isolat H dan isolat I yang artinya tidak adanya gelembung bagi reduksi H₂O₂. Isolat G menunjukan hasil positif  adanya gelembung.

4. Uji Gelatin

            Uji gelatin berfungsi menunjukkan kemampuan bakteri dalam hidrolisis gelatin. Gelatin yang telah dicerna oleh bakteri tidak mampu  membentuk gel dan bersifat cair. Actobacillus plantarum merupakan salah satu jenis BAL homofermentatif dengan temperatur optimal lebih rendah dari 37oC (Frazier dan Westhoff, 1988). L. plantarum berbentuk batang (0,5-1,5 s/d 1,0-10 _m) dan tidak bergerak (non motil). Bakteri ini memiliki sifat katalase negatif, aerob atau fakultatif anaerob, mampu mencairkan gelatin, cepat mencerna protein, tidak mereduksi nitrat, toleran terhadap asam, dan mampu memproduksi asam laktat. Dalam media agar, L. plantarum membentuk koloni berukuran 2-3 mm, berwarna putih opaque, conveks, dan dikenal sebagai bakteri pembentuk asam laktat (Lehninger 1995). Hasil percobaan adalah negatif pada semua strain bakteri artinya gelatin tetap padat dan bakteri tidak mampu mencairkan gelatin. Hal ini dapat disebabkan pada saat pengambilan isolat bakteri kurang aseptis dan kurang ketelitian dalam mengamati.

5. Uji Hidrolisis Kasein

            Uji kasein bertujuan untuk mendeteksi adanya pembentukan asam bakteri yang disebabkan oleh aktivitas bakteri yang bersifat mesofilik. Pada uji kasein hasil positif ditunjukkan adanya zona jernih disekitar koloni. Berdasarkan pengamatan dari semua isolat dari kelas A susu kasein setelah inkubasi selama 4 hari tidak ditemukan zona bening disekitar koloni bakteri hal ini dikarenakan pada saat pengambilan isolat bakteri dan dilakukan streak pada medium susu skim kurang aseptis dan kurang ketelitian dalam mengamati.

6. Fermentasi Karbohidrat

            Uji fermentasi karbohidrat adalah untuk melihat kemampuan bakteri dalam memfermentasikan karbohidrat yang ditandai dengan perubahan warna dan adanya gelembung udara. Tabung durham digunakan untuk mengikat oksigen. Phenol red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi campuran. Uji fermentasi karbohidrat dilakukan selama 24 jam dan 48 jam dimana pada perubahan warna uji glukosa menunjukan isolat D memiliki glukosa ++ dan glukosa +++ terdapat pada isolat B, isolat C, isolat F, isolat G, isolat H dan isolat I. Pada  glukosa ++++ didapatkan pada isolat A dan isolat E. Perubahan warna uji maltosa pada isolat D, isolat G dan isolat H memiliki maltosa +. Maltosa ++ terdapat pada isolat B, isolat C, isolat F dan isolat I. Isolat A menunjukan adanya maltosa +++. Uji laktosa pada isolat B, isolat C, isolat E, isolat F dan isolat I menunjukan laktosa + dan laktosa ++ terdapat pada isolat G dan isolat H. Laktosa +++ ditemukan pada isolat A. Uji Sukrosa hanya dilakukan 24 jam, hal ini disebabkan terjadinya kesalahan teknis pada saat penyimpanan sukrosa, sehingga data yang ada hanya dalam waktu 24 jam. Isolat A memiliki warna larutan sukrosa + dan sukrosa ++ terdapat pada isolat B. Isolat C dan isolat D memiliki warna larutan sukrosa +++ dan isolat F, isolat G, isolat H dan isolat I terdapat warna larutan sukrosa ++++.

            Isolat I tidak ditemukan adanya gelembung glukosa. Gelembung glukosa sedikit terdapat pada isolat B dan isolat C. Isolat D dan isolat H memiliki gelembung glukosa sedang. Gelembung glukosa banyak terdapat pada isolat A, isolat E, isolat F dan isolat G. Isolat B, isolat C dan isolat G  tidak ditemukan adanya gelembung maltosa. Gelembung maltosa sedikit terdapat pada isolat G. Isolat A, isolat D dan isolat E memiliki gelembung maltosa sedang. Gelembung maltosa banyak terdapat pada isolat F dan isolat H. Isolat B, isolat C, isolat G dan isolat I tidak ditemukan adanya gelembung laktosa. Gelembung laktosa sedikit terdapat pada isolat E. Isolat A, isolat F dan isolat G memiliki gelembung maltosa sedang. Gelembung maltosa banyak terdapat pada isolat H.

V. KESIMPULAN

Adapun kesimpulan yang dapat diperoleh dari praktikum ini adalah sebagai berikut:

1.      Pada praktikum ini menggunakan metode taksonomi numerik – fenetik dan data yang ditemukan sebanyak 56 karakter.

2.      Perhitungan nilai similaritas masing-masing karakter  menggunakan dua cara yaitu Simple Matching Coeficient (Ssm) dan Jaccard coeficient(Sj).

3.      Berdasarkan hasil analisis dendogram Simple Matching Coeficient (Ssm) didapatkan 6 spesies.

4.      Strain bakteri yang digunakan yaitu strain A, B, C, D, E , F ,G , H dan I. Masing masing strain tersebut di karakterisasi dengan pengamatan dan pengujian. Pengamatan meliputi sifat morfologi, baik koloni maupun sel dan dilanjutkan dengan pengujian sifat biokimia.

5.      Morfologi koloni NA tegak  didapatkan bentuk yang paling banyak adalah papilliaite. NA miring bentuk yang banyak adalah spreading. NB plate umum koloni sedang, bentuk koloni terdapat banyak irregular, bentuk tepian yang banayk dijumpai undulate dan elevasi paling banayk ditemukan berbentuk raised. NB cair berbentuk pelicle yang banyak ditemukan.

6.      Morfologi sel pada pewarnaaan sederhana didaptkan 3 bentuk sel yaitu Basil, Coccus dan Staphaylococcus. Pwarnaan gram didaptkan gram positif terdapat pada isolat A, isolat B, isolat C, isolat F dan isolat H. Pada gram negatif terdapat pada isolat D, isolat F, isolat G dan isolat I. Tidak ditemukan endospora pada semua isolat strain bakteri.

7.      Uji hidrolisis pati zona bening pada isloat A, isolat C, isolat E, isolat F, isolat H dan isolat I menunjukan bahwa bakteri positif terhadap hidrolisis pati. Terdapat bakteri negatif terhadap hidrolisis pati yaitu isolat B, isolat D. Pada Reduksi metilen blue hasil yang didapatkan untuk semua isolat bakteri negatif. Uji katalase hasil positif hanya terdapat pada isolat G. Uji gelatin menunjukan hasil negatif pada semua isolat, Lactobacillus plantarum yang mampu mencairkan gelatin. Hidrolisis pati tidak menunjukan zona bening pada semua isolat.  Fermentasi Karbohidrat pada uji warna glukosa +++ terdapat 6 isolat, uji warna maltosa +++ terdapat pada isolat A, uji warna laktosa isolat D tidak menunjukan adnya perubahan warna. Uji warna sukrosa hanya dilakukan 24 jam saja, pada isolat praktikan Isolat C bergelembung dan terjadi perubahan warna ++.

8.      Banyak ditemukannya karakter yang negatif menunjukkan bahwa proses pelaksanaan pengambilan isolat bakteri kurang aseptis dan kurangnya ketelitian dalam mengamati karakter dari bakteri tersebut.